抓住漏网之鱼——血清游离轻链

前言

临床实验室使用琼脂糖或醋酸纤维凝胶进行血清蛋白电泳（SPE）检测[1]，作为免疫球蛋白筛查方法之一，所需血清标本量较少、检测速度快。免疫固定电泳是对是血清区带电泳与免疫沉淀反应相结合的定性实验，属于免疫球蛋白鉴别的一种方法。它将抗血清直接加在电泳后的蛋白质表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，然后在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后可以对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。

免疫固定电泳（IFE）是鉴定单克隆免疫球蛋白（M蛋白）的金标准[2]，能分类和鉴定SPE检测到的可疑M蛋白。SPE检测M蛋白特异性较好，灵敏度较差。M蛋白主要出现在血清蛋白电泳的γ区，其次是β区、β-γ交界区，其中β区的M蛋白以免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）型为主[3]。

与IFE相比，前者容易漏检轻链型及不同克隆型来源的M蛋白，因此可作为辅助筛查M蛋白的方法之一[4] 。在IFE各条带类型中，IgG与IgM型条带多在γ球蛋白区带，IgA型条带多在β与β-γ球蛋白区带。IgA型单克隆免疫球蛋白通常向β球蛋白区带处迁移，与该区带中的非球蛋白成分如转铁蛋白、C反应蛋白、等形成共迁移现象[5]。

案例经过

患者，男性，78岁，以“尿蛋白增多3年，双眼睑水肿1月”为主诉入院。3年前患者无明显诱因出现中度蛋白尿增多，伴乏力,无咳嗽、咳痰、胸痛、双下肢浮肿等其他不适，1月前患者无明显诱因出现双眼睑水肿，尿量减少(具体尿量不详)，尿中泡沫增多，无双下肢水肿,无胸闷、气喘，无尿频、尿急、尿痛等。高血压病史5年，平素规律口服“缬沙坦胶囊80mg/日”。血压控制在130-150/100-80mmHg左右。

体格检查：正常面容，皮肤黏膜未见出血点，眼睑水肿，双肺叩击音清，未闻及干湿啰音，胸骨无叩痛，心率72次/分，律齐，未闻及杂音，腹软，无压痛反跳痛，双下肢无水肿。神经系统检查未见异常。

实验室检查结果：

1、血生化结果，如图1。

图1

2、随机尿生化结果，如图2。

图2

3、24小时尿生化结果，如图3。

图3

4、血常规结果，如图4。

图4

5、血免疫固定电泳（IFE）：IgA Kappa型，如图5。

图5

6. 血清蛋白电泳（SPEP）结果：

图6

7、尿本周蛋白检测结果：l轻链、l游离轻链泳道发现异常单克隆条带，尿本周氏蛋白阳性，类型为l游离轻链型。

8、血清游离轻链定量（FLC）检测结果：血清游离轻链-k：21.60mg/L,血清游离轻链-l:1290.00mg/L，血清游离轻链-k/l为0.02,提示单克隆丙种球蛋白，伴随骨髓抑制。

9、骨髓活检:流式细胞检查：PC门细胞占有核细胞的2.01%,表达CD38、CD138、cLambda、BCMA，部分表达CD117、CD56、CD27，不表达cKappa、CD81、CD19，为Lambda单克隆异常表型浆细胞。BCMA阳性细胞占有核细胞的88.38%。

10、镜下可见骨髓增生减低(10%)，脂肪组织明显增多，部分区域可见一类细胞增多。组化染色:网状纤维染色(NF-0级).免疫组化:CD38(散在及小簇)，CD138(散在及小簇)，Kappa(-),Lambda(+)，CD20(-)，CD56(-),CD53(-)。

临床诊断：结合以上考虑Lambda单克隆细胞增多(约占有核细胞10%)。

案例分析

问题1、血清蛋白电泳和免疫固定电泳的结果不相符，血清蛋白电泳结果阴性而免疫固定电泳结果阳性。

结果分析：由于IgA型M区带(特别是浓度不是很高的患者,或经治疗后的患者扫描峰型)较IgG、IgA、IgM型及高值IgA型M成分比较有峰低底宽且与β、a₂成分重叠而出现不典型M带等特点易漏诊[6]。 

在翟洪顺等[7]的相关研究中，44例MM患者在血清蛋白电泳的检测中有39例出现M蛋白带，5例未出现蛋白带（包括3例轻链型及2例IgA型MM）。92％以上的多发性骨髓瘤（MM）患者在血和（或）尿免疫固定电泳中出现M蛋白的条带[8]，由此可见该患者血清蛋白电泳未出现M蛋白组分也可以理解。

问题2、在血清游离轻链-l高达1290.OOmg/L时，血清蛋白电泳、免疫固定电泳均未检测出。

问题出在哪里?为了找到原因，将标本送到兄弟医院进行检测比对，结果如图7。同时为了避免第一次做实验的时候抗体加错和血清抗原-抗体浓度比例不合适导致抗原抗体复合物不牢固现象，将原血清复融重新做了两次实验，结果如图8和图9。

图7

图8

图9

结果分析：经过查询文献，SPEP检测下限为0.3~0.5 g/L；血IFE可检出血中高于0.2 g/L的M蛋白，而尿IFE可检出尿中低至0.04 g/L的M蛋白；FLC检测灵敏度为0.01~0.03g/L[9]。理论上，病人血清中的游离轻链结果是血IFE检测下限的6倍左右，是SPEP检测下限的2.6-4倍左右，二者均应该可以检测出来。通过图7、图8和图9的比对，很有可能是抗血清试剂出现了问题。

问题3：抗血清试剂是不是真的出了问题？接下来需要排除试剂的质量问题。

通过观察当天其他标本的实验结果，如图10，和第二天其他标本的实验结果，如图11。

图10

图11

结果分析：通过观察图10和图11，说明试剂的质量是没有问题的。

再来分析不同试剂的成分。不同厂家的抗血清试剂可能抗体和轻链结合的部位不一样。我们实验室使用的是美国海伦娜的试剂（SP泳道3倍稀释，其他泳道5倍稀释），而兄弟医院使用的是法国赛比亚的试剂（IgG泳道3倍稀释，其他泳道6倍稀释）。

前者的抗血清成分是含有单克隆抗人免疫球蛋白IgG，lgA，IgM重链，Kappa轻链和Lambda轻链的抗体；抗血清源自山羊和绵羊[10]。所有抗体均含有叠氮钠作为保护剂[9]。后者抗血清的成分是哺乳动物免疫球蛋白抗人γ重链、α重链、μ重链，抗人免疫球蛋白抗人k（自由和结合）轻链、l（自由和结合）轻链[11]。

血清总轻链检测位点是轻链与重链结合的外侧暴露位点，血清游离轻链检测的是轻链内侧的隐藏位点，当轻链游离出来才能被检出。

综合以上分析，之所以本实验室未检测出，很有可能是病人体内产生的游离Lambda轻链内侧的隐藏位点不能和本实验室的抗血清结合导致的。

知识扩展

M蛋白是单克隆浆细胞恶性增殖产生的均一蛋白，见于一组疾病，包括意义不明的单克隆丙种球蛋白病（良性单克隆丙种球蛋白病）、多发性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤或髓外浆细胞瘤、巨球蛋白血症、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和原发性系统性淀粉样变病等[18]。

高浓度的M蛋白可能预示疾病发展的进程加快，更易于通过SPE筛选发现[5]。有临床意义的单克隆免疫球蛋白血症（monoclonal gammopathies of clinical significance, MGCS）是一组以血或尿中存在单克隆免疫球蛋白（M蛋白）及其所造成的器官损害为主要临床特征的疾病[15]。

MGCS的疾病谱非常广泛、疾病表现多样，临床表现高度异质性，而且大多为少见/罕见疾病，因此容易被漏诊和误诊[15]。所以，在临床应用中应联合多种方法进行M蛋白的定性及定量检测[15]。

总    结

SPE检测M蛋白特异性较好，灵敏度较差。与IFE相比，前者容易漏检轻链型及不同克隆型来源的M蛋白，因此可作为辅助筛查M蛋白的方法之一[12]。

IFE其特点是非常有效的联合了电泳技术的分离作用和免疫蛋白特异性的生物学特性，从而将两者相结合，大大提高了检测的阳性率[13]。1976年IFE被确定为抗体的检测方法，被应用于免疫球蛋白及M蛋白的分型研究[14]。

血清游离轻链（FLC）一般采用免疫散射比浊法检测[15]。通过可特异性结合FLC的针对免疫球蛋白轻链结合面表位的抗体，可进行极低浓度的FLC检测；并通过计算游离κ和游离λ的比值判读出轻链的克隆性。

血清游离κ/λ比值的正常值为0.26~1.65，超过1.65代表存在单克隆κ型轻链；低于0.26则代表存在单克隆λ型轻链。其检测灵敏度（10~30 mg/L）较SPEP和IFE进一步提高，可以对微量M蛋白进行定量监测[16]。血清游离轻链（serum free light chain，sFLC）是筛查MM及相关浆细胞疾病时灵敏度较高的指标，sFLC检测还有助于对轻链淀粉样变性和轻链型MM患者进行定量监测和疗效判断[17]。

血清蛋白电泳（SPEP）、血/尿免疫固定电泳（IFE）及血清游离轻链（FLC）比值、重轻链（HLC）比值都可用于检测患者是否存在M蛋白。每种方法各有优缺点，在临床应用中应联合上述多种方法进行M蛋白的定性及定量检测[15]。所以，临床医生可根据病人的试剂需要对不同的项目进行组合检测，这也需要检验科和临床保持密切的沟通。另外，不同资历的工作人员可能对可疑M蛋白的判读有不一致的结果，需要工作人员提高自身的专业知识，且对患者的临床背景作全面的了解[5]。

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国赛Omlipo及Aristo系列特定蛋白分析仪可用于FLC的检测，仪器性能稳定，自动化程度高，采用经典免疫散射比浊法，准确性高。

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（1）灵敏度高，可达3mg/L；

（2）高性能抗体能有效识别多个免疫球蛋白轻链抗原隐藏结合表位，避免漏诊；

（3）抗原过剩自动稀释重测，可准确地检测出高值样本，避免钩状效应，更好地满足临床需求。

【参考文献】

[1]Vavricka SR , Burri E , Beglinger C ,et al. Serum protein electrophoresis: an underused but very useful test[J]. Digestion, 2009,79(4):203-210.DOI: 10.1159/000212077 . 

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[10]海伦娜单克隆免疫球蛋白测定试剂盒中文说明书.

[11]Sebia免疫固定检测试剂盒（电泳法）说明书.

[12]Bakker AJ , Elderman-van der Werf C , van Abbema T . Detection and quantification of M-proteinemia: comparison of various methods for serum protein electrophoresis[J]. Clin Chem Lab Med, 2011,50(1):77-80. DOI: 10.1515/CCLM.2011.723 .

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作者：梁利芳 赵贺红 张峥

单位：开封市人民医院

转载：检验医学